IDT腫瘤突變負(fù)荷（TMB）解決方案
——NGS二代測(cè)序基因檢測(cè)


北京澤平代理的美國(guó)進(jìn)口IDT NGS二代測(cè)序產(chǎn)品，通過文庫(kù)構(gòu)建試劑盒、基因檢測(cè)Panel、定制化雜交捕獲探針組等高品質(zhì)試劑，助力腫瘤突變負(fù)荷（TMB）實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)研究。


一、背景介紹

腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutational burden, TMB）一般指特定基因組區(qū)域內(nèi)每兆堿基對(duì)（Mb）體細(xì)胞非同義突變的個(gè)數(shù)，可以間接反映腫瘤產(chǎn)生新抗原的能力和程度，已被證實(shí)可預(yù)測(cè)多種腫瘤的免疫治療效果。近年來，越來越多的數(shù)據(jù)證實(shí)TMB越高的腫瘤，新抗原負(fù)荷越高，更有可能從免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitors, ICls）治療中獲益。

目前檢測(cè)TMB的方法主要為基于二代測(cè)序技術(shù)（NGS）的全外顯子組測(cè)序（WES）和定制靶向Panel測(cè)序。WES可檢測(cè)整個(gè)外顯子中的體細(xì)胞突變，提供腫瘤突變的圖譜，因此，WES也被認(rèn)為是TMB檢測(cè)的"金標(biāo)準(zhǔn)”。同時(shí)，采用靶向Panel進(jìn)行腫瘤基因組學(xué)分析已成為TMB檢測(cè)的另一種重要手段。研究人員可以根據(jù)前沿進(jìn)展及臨床需求，開發(fā)針對(duì)腫瘤基因的產(chǎn)品，結(jié)合生物信息學(xué)算法快速高效地檢測(cè)腫瘤靶基因組改變。



 

 
二、IDT NGS二代測(cè)序解決方案

1、IDT xGen cfDNA & FFPE DNA 文庫(kù)制備試劑盒——建立高質(zhì)量文庫(kù)

IDT xGen cfDNA & FFPE DNA 文庫(kù)制備試劑盒，能夠?qū)ξ⒘緿NA樣本進(jìn)行靈敏且準(zhǔn)確的變異檢測(cè)。通過兩步連接法，可獲得理想的文庫(kù)轉(zhuǎn)化率，同時(shí)抑制接頭二聚體的形成。在單鏈連接的過程中可引入特異性的分子標(biāo)簽（UMI）序列，以適配多種去重和錯(cuò)誤校正的方法。用低質(zhì)量樣本建立高質(zhì)量文庫(kù)，助力TMB檢測(cè)。

IDT文庫(kù)制備試劑盒優(yōu)勢(shì)

①為困難樣本量身打造，更大化數(shù)據(jù)輸出；

②提升樣本轉(zhuǎn)化率，達(dá)到更高的文庫(kù)復(fù)雜度；

③結(jié)合UMI糾錯(cuò)處理，實(shí)現(xiàn)低頻突變的檢測(cè)。
 


圖. IDT xGen cfDNA & FFPE DNA 文庫(kù)制備試劑盒可從不同質(zhì)量的FFPE樣本中獲得更高的文庫(kù)產(chǎn)量和文庫(kù)復(fù)雜度。使用25ng不同質(zhì)量的FFPE標(biāo)準(zhǔn)品按照IDT提供的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行文庫(kù)制備，并用61kb的定制Panel進(jìn)行捕獲。

 


2、IDT xGen Exome Hyb Panel v2 全外顯子雜交捕獲探針組——高覆蓋度全外顯子組測(cè)序WES

IDT xGen Exome Hyb Panel v2 全外顯子組雜交捕獲探針組，由415,115條單獨(dú)合成且經(jīng)過質(zhì)檢的IDT xGen Custom Hyb Panel - Production 捕獲探針組成。全外顯子探針組跨越人類基因組的34Mb目標(biāo)區(qū)域（19,433個(gè)基因），并且覆蓋39Mb的探針空間（即由探針覆蓋的基因組區(qū)域)）。IDT全外顯子探針使用新型“捕獲感知（capture-aware）”算法進(jìn)行設(shè)計(jì)，并進(jìn)行了特殊的脫靶分析，以實(shí)現(xiàn)更完整的設(shè)計(jì)覆蓋度。IDT全外顯子探針組中的所有探針均嚴(yán)格按照ISO13485標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行生產(chǎn)，每條探針均經(jīng)過質(zhì)譜法和雙定量檢驗(yàn)，保證探針的質(zhì)量及在探針庫(kù)中的濃度，是穩(wěn)定可靠的高覆蓋度WES捕獲工具。



圖. IDT外顯子探針一致的批次穩(wěn)定性，減少昂貴的重新驗(yàn)證。使用100ngDNA建庫(kù)，并對(duì)8個(gè)樣本進(jìn)行混合捕獲（8混)）。兩名操作人員分別在不同日期和不同地點(diǎn)進(jìn)行捕獲。IDT埃德特的xGen Exome Hyb Panel v2 外顯子測(cè)序探針組的線性回歸線與預(yù)測(cè)的“完全”相關(guān)線高度接近，其中R2值為0.76。
 

圖. IDT xGen Exome Hyb Panel v2 全外顯子探針組在捕獲效率方面表現(xiàn)出色。根據(jù)IDT外顯子組探針捕獲實(shí)驗(yàn)方案，對(duì)文庫(kù)進(jìn)行捕獲和多重富集，獲得單樣本和12混（分別為IDT-1和IDT-12）捕獲的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。以Illumina NextSeq 測(cè)序儀高通量模式對(duì)2×100雙端reads進(jìn)行測(cè)序。用Picard按每個(gè)文庫(kù)5Gb確定中靶堿基（選定堿基百分比)。

 

 
3、IDT xGen Custom Hyb Panels - Production 探針庫(kù)——高性能捕獲探針

除WES測(cè)序外, TMB還可以通過定制化測(cè)序Panel進(jìn)行檢測(cè)，這些Panel需要使用質(zhì)量可靠的捕獲探針組。IDT xGen Custom Hyb Panels - Production 捕獲探針庫(kù)是帶有5'端生物素標(biāo)記的DNA探針，每一條探針均經(jīng)過單獨(dú)合成、單獨(dú)質(zhì)檢，可用于二代測(cè)序?qū)嶒?yàn)中目標(biāo)DNA序列富集。實(shí)驗(yàn)證明，與市場(chǎng)上其他通過微陣列合成的捕獲探針相比，IDT xGen Custom Hyb Panels - Production 捕獲探針的捕獲均一性更高，GC偏好性更小，能以更少的數(shù)據(jù)投入獲得更佳的測(cè)序深度。IDT xGen Custom Hyb Panels 探針庫(kù)采用模塊化合成制備和使用，既可以獨(dú)立使用，也可以用spike-in panel 的形式與現(xiàn)有的探針庫(kù)結(jié)合使用，具有非常高的靈活性。

IDT Custom Hyb Panels - Production 探針庫(kù)優(yōu)勢(shì)

①單獨(dú)合成、單獨(dú)質(zhì)控的探針，實(shí)現(xiàn)高效、均一的目標(biāo)序列富集；

②模塊化設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)、高效的定制和簡(jiǎn)單輕松的目標(biāo)序列擴(kuò)充；

③嚴(yán)格質(zhì)控降低批次間差異。
 


圖.使用IDT的探針庫(kù)實(shí)現(xiàn)高度均一的目標(biāo)區(qū)域覆蓋。針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品基因組DNA（Coriell）構(gòu)建文庫(kù)，使用IDT xGen Custom Hyb Panels -Production 探針庫(kù)進(jìn)行捕獲反應(yīng)（目標(biāo)區(qū)域?yàn)?8kb）。采用Illumina NextSeq 測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)600K reads進(jìn)行生信分析。結(jié)果顯示，（A）單次測(cè)序的覆蓋均一度較高；（B）同一個(gè)探針庫(kù)的兩個(gè)不同批次，顯示出較高的一致性。

 
 

三、IDT TMB成功案例



中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院團(tuán)隊(duì)基于NGS Panel 檢測(cè)血液腫瘤突變負(fù)荷（bTMB），驗(yàn)證了bTMB作為非小細(xì)胞肺癌患者免疫治療的生物標(biāo)志物的可行性。該研究使用了IDT的定制化Panel和IDT xGen Exome Hyb Panel 進(jìn)行檢測(cè)。研究納入48例晚期非小細(xì)胞肺癌外周血及腫瘤組織配對(duì)標(biāo)本。NCC-GP150計(jì)算的bTMB與WES計(jì)算的TMB間的Spearman相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.62；當(dāng)bTMB≥6時(shí)，約登指數(shù)達(dá)到最佳（0.59，敏感性88%，特異性71%）。

參考文獻(xiàn)

Zhijie Wang. Jianchun Duan, Shangli et al. Assessment of blood tumor mutational burden as a potential biomarker for immunotherapy in patients with non-small cell lung cancer with use of a next-generation sequencing cancer gene panel. JAMA Oncol. 2019;5(5):696-702.

  


四、IDT腫瘤突變負(fù)荷相關(guān)產(chǎn)品
 

 


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